養(yǎng)好細(xì)胞注意點(diǎn)
(一)冷凍管應(yīng)如何解凍
取出冷凍管后,須立即放入37 ℃ 水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化,并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí),必須注意**,預(yù)防冷凍管的爆裂。
(二)細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí),DMSO如何處理
在細(xì)胞解凍之后,可直接離心去除DMSO,用新鮮的培養(yǎng)基懸浮后直接放入含有 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),如此可避免解凍后細(xì)胞生長受到DMSO影響。
(三)可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基
每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基,若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基,細(xì)胞大都無法立即適應(yīng),造成細(xì)胞無法存活,不應(yīng)該馬上替換。
(四)可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類
血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營養(yǎng)來源,所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清,在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無法存活。
(五)何謂 FBS,F(xiàn)CS,CS,HS
FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calf serum) 是相同的意思,兩者都是指胎牛血清。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。
(六)培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用 5% 或 10% CO2
一般培養(yǎng)基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作為 pH 的緩沖系統(tǒng),而培養(yǎng)基中 NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的 CO2 濃度。理論當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 含量為每公升 3.7 g 時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用 10% CO2;當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 為每公升 1.5 g 時(shí),則應(yīng)使用 5% CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。
(七)何時(shí)須更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中是否須添加***。
視細(xì)胞生長密度而定,或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時(shí)間,按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。
一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,培養(yǎng)基中可以添加***。 按1%體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素),使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 μ/mL。
(八)貼壁細(xì)胞傳代時(shí)所使用的 trypsin-EDTA 濃度及相應(yīng)處理
一般使用的 trypsin-EDTA 濃度為 0.25% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。**次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中,保存于 –20 ℃,避免反復(fù)冷凍解凍造成 trypsin 的活性降低,并可減少污染的機(jī)會(huì).。
(九)將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來,離心速率多少
回收動(dòng)物細(xì)胞,其離心速率一般為 1 000 rpm,5~10 分鐘,過高的轉(zhuǎn)速,將造成細(xì)胞死亡。
(十)細(xì)胞的接種密度
依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長的重要原因之一。
(十一)細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基的成分及DMSO的等級(jí)
動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)*常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5~10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和 90~95 % 原來細(xì)胞生長用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意:由于 DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能,故不可將 DMSO 直接加入細(xì)胞液中,必須使用前先行配制完成。冷凍保存使用的 DMSO 等級(jí),必須為 Tissue culture grade 的 DMSO ,其本身即為無菌狀況,**次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中避光保存。
(十二)冷凍保存細(xì)胞的方法及冷凍細(xì)胞濃度
將貼壁細(xì)胞消化后離心收集,懸浮細(xì)胞直接離心收集,以含有DMSO完全培養(yǎng)基或胎牛血清的凍存液重懸細(xì)胞至終濃度約1x106/ml。。以每管1~2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過夜。次日保存到液氮中。
冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial,融合瘤細(xì)胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。
(十三)如何避免細(xì)胞污染
細(xì)胞污染的種類可分成**、**、霉菌、病毒等。主要的污染原因?yàn)闊o菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染的血清和污染的細(xì)胞等。嚴(yán)格無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好的細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染的*好方法。
(十四)支原體 (mycoplasma)污染的細(xì)胞, 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響
不能以肉眼觀察出支原體污染異狀。除極有經(jīng)驗(yàn)的專家外,大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株,無法以其外觀分辨。
支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞的生長參數(shù),代謝及研究任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前,必須確認(rèn)細(xì)胞為 mycoplasma-free,實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)方有意義。
(十五)培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中,顏色會(huì)偏暗紅色,且 pH 值會(huì)越來越偏堿性
培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中,培養(yǎng)基內(nèi)的 CO2 會(huì)逐漸溢出,造成培養(yǎng)基越來越偏堿性,而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑 (通常為 phenol red)的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果,將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí),可以通入無菌過濾 CO2 ,以調(diào)整 pH 值?;蛩釅A調(diào)PH。
(十六)L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎?它在溶液中不穩(wěn)定嗎?
L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解,L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成,而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。
(十七)什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么?
酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH 值的指示劑:中性時(shí)為紅色,酸性時(shí)為黃色,堿性時(shí)為紫色。由于酚紅干擾檢測(cè),一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí),不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源,盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。